Разработка зоопсихофизической методики для определения хемочувствительности гидробионтов

Представлены исходная, промежуточные и итоговая версии зоопсихофизической методики. Их критический анализ и поэтапная модификация в итоге позволили прийти к версии, адекватной задачам определения пределов и закономерностей хемочувствительности рыб и других гидробионтов. Разбор недостатков исходной и промежуточных версий этой методики может помочь при разработке других зоопсихофизических методик.

Исследование хемочувствительности гидробионтов важно как с научной точки зрения, например, для сравнения с хемочувствительностью обитателей суши, в частности, человека, так и для практического применения. Во втором случае - при промышленном или спортивном лове и разработке приманок, при искусственном разведении, при выращивании в контролируемых акваториях на естественных и искусственных кормах, при контроле естественного нереста ценных проходных видов рыб, а также при разработке искусственных кормов и разного рода химических аттрактантов и репеллентов. Систематическое изучение хемочувствительности рыб с применением отлаженных методов исследований началось более ста лет назад.

Предшествующие методы измерения хемочувствительности рыб

Первым по времени был разработан и применен метод парного выбора: сначала при исследовании способности необученных рыб различать два разных по качеству потока воды (Shelford, Allee, 1913), позднее при изучении дифференциальной чувствительности обученных рыб к растворам пищевого и солевого стимулов разной концентрации (Bull, 1928, 1930, 1952). Метод парного или множественного выбора прост и нагляден как в полевых, так и в лабораторных условиях, и поэтому в отдельных случаях он с успехом применяется по сей день, однако зависимость результатов измерений от мотивационного состояния рыб ограничивает его применение. Например, в межнерестовый период лососевые рыбы не проявляют заметного предпочтения запаха родного ручья, что мешает выявить их природную способность различать запахи родного и соседнего ручьев.

Первые попытки проградуировать ответные реакции рыб на обонятельный пищевой стимул были предприняты в начале прошлого века и отражены в обзоре Паркера (Parker, 1922). В нем были описаны 4 градации ответа групп рыб (американских сомиков) на пищевой стимул по мере нарастания его концентрации. Позднее подобный метод шкалирования поведенческого ответа для оценки интенсивности поведенческой реакции рыб разработали отечественные ихтиологи (Касумян, 1994; Касумян, Пащенко, 1982). С помощью этого метода для каждой градации пищевого или другого специфического ответа можно определить пороговую концентрацию, в том числе и для пищевой привлекательности стимула, однако для определения порога распознавания, а тем более порога ощущения стимула метод шкалирования специфического ответа не годится.

В определении порогов ощущения (детекции) химических стимулов большое значение имеет электрофизиологический метод регистрации ответной активности различных отделов хемосенсорных систем рыб. Первые значительные работы, осуществленные этим методом, опубликованы в 1970-х гг. (Caprio, 1975; Hara, 1973; Sutterlin, Sutterlin, 1971; Suzuki, Tucker, 1971), основной их пик пришелся на 1980-1990-е гг. (Ильин и др., 1983; Малюкина и др., 1990; Byrd, Caprio, 1982; Evans, Hara, 1985; Kang, Caprio, 1995; Kanwal, Caprio, 1983; Kanwal Hidaka, Caprio, 1987; Kawamura, Tamura, 1980; Kobayashi, Goh, 1985; Marui et al., 1983), но и в 2000-х гг. они продолжаются (Chervova, Lapshin, 2005; Kohbara, Caprio, 2001). В большинстве этих работ были определены пороговые концентрации веществ, но с появлением в 1980-х гг. возможности использовать в опытах в качестве фона искусственную воду круг измеряемых показателей заметно расширился, и группа Джона Кэприо (США) смогла определить и абсолютные пороги для отдельных аминокислот, используя для их вычисления графические зависимости типа «доза-ответ» как аналог психометрической кривой. Однако вопрос о том, как с помощью электрофизиологического метода определить у рыб гораздо более важный показатель - дифференциальную чувствительность, остается открытым. Кроме того, поскольку отсутствуют данные о результатах параллельного применения электрофизиологических и этологических или психофизических методов для оценки хемочувствительности рыб, также отсутствуют сведения о том, в какой степени и насколько точно хемочувствительность, измеренная на уровне объекта (разных отделов хемо- сенсорных систем), отражает хемочувствительность субъекта (особи или группы особей).

Этологический метод в качестве показателя чувствительности предполагает рассмотрение поведенческого ответа. Поведенческие ответы рыб весьма разнообразны, но для определения пороговых концентраций в лабораторных и полевых условиях наиболее удобными оказались такие показатели, как «двигательная активность», «ориентированные перемещения», «сосредоточение-разрежение группы особей» в зоне предъявления контрольных и тестовых растворов (Шпарковский, Павлов, Чинарина, 1983; Dempsey, 1978; Pawson, 1977). В том случае если результаты поведенческих тестов были сопоставимы с результатами электрофизиологических опытов для данного семейства рыб, авторы исследования рассматривали такие поведенческие ответы, как «пороги восприятия» (Шпарковский, Павлов, Чинарина, 1983), но с оговоркой, что цель измерить пороги с помощью данной методики не достигнута или не ставилась. В тех работах, где такая цель ставилась, авторы при тестировании интуитивно или осознанно использовали психофизический метод, в частности, метод границ (Сергеева, 1975; Dempsey, 1978; Pawson, 1977; Sutterlin, Sutterlin, 1971; Suzuki, Tucker, 1971) или его модификацию - метод лестницы (Johnstone, 1980). При этом в работах, где психофизический метод тестирования применялся в паре с методом объективной сенсометрии (у бодрствующих рыб с предварительно выработанным условным кар­диальным рефлексом регистрировали изменение частоты сердечных сокращений), у карпа были определены дифференциальные пороги для ионов Cl^- при его добавлении и уменьшении относительно заданного фона (Сергеева, 1975), а у трески - дифференциальные пороги для аминокислоты глицина при его добавлении относительно трех значений заданного фона (Johnstone, 1980). К сожалению, эти пионерские, с точки зрения использованных методик, работы не получили продолжения в силу разных причин, но главным образом из-за претензий к тестированию предварительно обученных рыб и к использованию искусственных фонов, на порядки превышающих естественный фон (следствием чего является значительное снижение показателей дифференциальной чувствительности рыб к минеральным солям и аминокислотам).

Учитывая все достоинства и недостатки предшествующих методик и опираясь на работы отечественных физиологов (Анохин, 1968; Нейронные механизмы ориентировочного рефлекса, 1970; Ориентировочный рефлекс и ориентировочно-исследовательская деятельность, 1958; Соколов, 1981) и психофизиков (Бардин, 1974, 1976; Забродин, 1977; Забродин, Лебедев, 1977; Михалевская, 1972), Б.В. Солуха в конце 1980-х гг. предложил свою методику определения чувствительности позвоночных животных к внешним стимулам разной модальности (Солуха, 1986, 1989).

Исходная версия авторской методики

В предложенной Б.В. Солухой (Солуха, 1989, с. 66-72) методике измерения чувствительности рыб к химическим стимулам используется адаптированный им для ихтиологических задач классический психофизический метод постоянных стимулов. Для определения показателей реагирования «... визуальная или аппаратурная регистрация параметров двигательной активности проводится на двух интервалах - фоновом и стимульном. Желательно, чтобы длина этих интервалов была одинаковой и фоновый интервал непосредственно (без промежутка) предшествовал стимульному. Предполагается, что на стимульном интервале экспериментатор может воздействовать на животное некоторым раздражителем (тестовая ситуация), но может и не делать этого (контрольная ситуация). Изменение регистрируемого параметра во времени в пределах фонового и стимульного интервалов назовем реализацией опыта.

На каждом интервале наблюдения с некоторым шагом отсчитываются значения регистрируемого параметра (в нашем случае это число рыб в зоне регистрации - интегральная оценка). Промежуток между отсчетами (шаг) выбирается так, чтобы они были независимыми в статистическом смысле или хотя бы некоррелированными» (там же, с. 66-72). Здесь и далее в кавычках приводятся дословные цитаты из описания авторской методики. На практике шаг для учета рыб обычно выбирается по среднему числу секунд, затрачиваемых рыбами данного вида и размера (возраста) на пересечение зоны регистрации в отсутствие стимуляции. Так, для взрослой балтийской трески шаг составлял 6 с, а для молоди русского осетра - 3 с.

«Каждая реализация соответствует одному предъявлению стимула или пустой пробе. Обычно предъявляется несколько одинаковых стимулов. Их предъявление осуществляется по программным психофизическим процедурам. Реализации, соответствующие одинаковым стимулам, сводятся в общую таблицу-протокол:

Здесь ИВ - измеряемая величина (отсчет регистрируемого параметра активности); К - частный показатель реагирования, представляющий собой нормированные к фоновому среднему отсчеты регистрируемого параметра активности. Длительность интервала наблюдения 60 с. Отражены первые две реализации. Округление проведено с точностью до 0,1.

Обработка и оценка данных регистрации проводится методом порогового сечения по критерию Неймана-Пирсона. Вкратце «... процедура обработки по критерию Неймана- Пирсона включает следующие операции.

1.    Определение отсчетов на фоновом и стимульном интервалах каждой реализации (это делается в случае обработки актограмм, полученных при аппаратурной регистрации, а при визуальной регистрации отсчеты равны числу рыб в зоне регистрации и вносятся в протокол опыта на каждом шаге реализации) и составление протокола первичной обработки.

2.    Определение фоновых средних и (1-я) нормировка к ним отсчетов для каждой реализации отдельно (определение частных показателей реагирования К). Нормировка к фоновому среднему позволяет устранить влияние нестационарности на результаты измерений. В противном случае вариабельность фоновой активности может замаскировать слабые реакции.

3.    Построение гистограмм значений частных показателей реагирования в тестовых и контрольных ситуациях (для наглядности они приведены в публикациях, а в рабочих условиях чаще составляются эквивалентные по смыслу гистограммам таблицы распределений по классам - в диапазоне 0,0-2,0 с шагом 0,1 для крайних и 0,2 для промежуточных классов - частот значений частных показателей реагирования).

4.    Выбор порогового сечения гистограммы и определение оценок вероятности ложной тревоги по контрольной гистограмме и оценок вероятности правильного обнаружения реакции по тестовым гистограммам.

Обязательное условие: оценка вероятности правильного обнаружения реакции определяется при тех же параметрах измерителя-обнаружителя, что и ложной тревоги.

Общим для всех версий данной методики при тестировании рыб в замкнутом объеме и визуальной регистрации является следующее: группы рыб тестируются в боксе с равномерным протоком воды, примерно равным по интенсивности с таковым в ручье или реке. Тестовый или контрольный раствор через канюлю подаются в питающий водой шланг непосредственно перед его входом в бокс и равномерно поступают в бокс вместе с проточной водой за счет подсоса струи протока на протяжении всего тестового или контрольного интервала. В ближайшей к входному отверстию шланга четвертьсфере концентрация подаваемого раствора по предварительным замерам с красящим раствором уменьшается в пределах 0,5-1 порядка. В этой четвертьсфере на дне делается полукружная разметка с несколькими радиусами, например, 5, 7,5, 10 и 12,5 см, и при тестировании она служит зоной регистрации находящихся в ней рыб. Вода вытекает из бокса через отверстия в противоположной торцевой стенке. За счет протока и разведения подаваемого раствора в боксе создается градиент предъявляемого запаха. Рыбы свободно перемещаются по боксу, например, для осетровых характерны «пристеночные» маршруты, включая дно и «потолок». Некоторые рыбы прерывают равномерное движение и выстраиваются в зоне втока навстречу протоку. Привлекательный запах, поступающий с проточной водой, вызывает скопление рыб у вто- ка (в зоне регистрации), а отталкивающий - уход рыб из зоны втока. Поэтому число рыб в этом случае является регистрируемым параметром - учет ведется по головам, находящимся в зоне регистрации. Этот параметр отражает отношение рыб к предъявляемому запаху и, в частности, изменение их двигательной активности: если запах привлекает, то пересекающие зону регистрации рыбы притормаживают, если отпугивает - быстро проскакивают, если безразличен - продолжают двигаться равномерно и число учитываемых рыб не меняется.

Промежуточные версии авторской методики

Уже в первой работе, выполненной по исходной версии (Суханова и др., 1989), была показана чрезвычайно высокая чувствительность гуппи к химическим пищевым раздражителям. Но по мере надобности в схему тестирования вносились изменения.

Итак, на фоновом интервале мы регистрируем ответ на спонтанные изменения фона (Ф), на стимульном интервале в случае контроля - ответ на Ф и ответ на процедуру стимуляции (П); суммарный ответ на эти два независимых фактора можно формально представить как их произведение, т. е. ФхП, а в случае теста - ответ на Ф, П и собственно тест (Т), т. е ФхПхТ. По мысли автора методики, последовательная нормировка к фону и контролю позволяют вычленить ответ рыб на тест в чистом виде. Однако по мере применения методики обнаружилось, что у рыб происходит не только спонтанное (кратковременное), но и долговременное циклическое изменение фоновой активности, которое примерно описывается синусоидой с длительностью цикла, например, для молоди русского осетра, около 4 часов. Следовательно, для полного учета фоновой активности нужно увеличить число контрольных реализаций до числа тестовых и чередовать их так, чтобы не только «фоновый интервал непосредственно (без промежутка) предшествовал стимульному», но и контроль тесту. Для этого две двухинтервальные реализации Ф^К и Ф^Т сначала были объединены автором исходной версии в одну четырехинтервальную Ф^К^Ф^Т, а затем - путем упразднения второго фонового интервала - в трехинтервальную Ф^К^Т. Четы- рехинтервальная версия была опробована в эксперименте, однако результаты не были опубликованы. В трехинтервальной версии обнаружились существенные недостатки, и в проводимых под руководством автора экспериментах с радужной форелью и в последующих самостоятельных экспериментах с карпом, балтийской треской и русским осетром эта версия методики была заменена на итоговую версию. Однако существуют опубликованные работы, где трехинтервальная версия методики применялась уже после внедрения итоговой версии (Суханова, 1992, 1993).

Здесь необходимо остановиться на недостатках и ограничениях предложенной первоначально трехинтервальной версии методики. Казалось бы, проблема учета цикличности фоновой активности решена, но тут же возникла другая проблема: два подряд стимуль­ных интервала (контрольный и тестовый) вызывали у рыб привыкание к процедуре стимуляции, которое маскировало ответ на тест, особенно при очень низких, близких к контролю концентрациях теста. Кроме того, при обработке данных тестирования по трехин- тервальной версии контрольный интервал (ФхП) рассматривался как фоновый интервал для тестового интервала (ФхПхТ). И если при обработке данных двухинтервальной версии мы при первой нормировке получали П и ПхТ, а при второй нормировке - Т - ответ на тест в чистом виде, то при обработке по той же схеме данных трехинтервальной версии мы при первой нормировке получаем П - ответ на процедуру в чистом виде и Т - ответ на тест в чистом виде, а при второй нормировке - Т/П - дробь, обозначающую непонятный показатель.

Итоговая версия методики

В поисках решения этой проблемы у меня возникла мысль не устранять, а использовать привыкание, вернувшись к двухинтервальной реализации, построенной по аналогии с той, что применяется при исследовании различительной способности у животных и у неспособных дать вербальный ответ младенцев в тесте «привыкание-различение» или habituation-discrimination test (Bornstein, Kessen, Weiskopf, 1976; Halpin, 1974; Schultze-Westrum, 1969), а именно по схеме Т^Т₂. В серии предварительных опытов с радужной форелью со схемами предъявления К^К для контрольного раствора и Т^Т для тестовых растворов разного качества было установлено, что при повторном предъявлении одного и того же стимула степень привыкания или степень снижения интенсивности ответа рыб на втором интервале предъявления является величиной статистически постоянной не только для растворов определенного качества, но и для конкретной концентрации данного тестового раствора. Это позволило с помощью модифицированной методики исследовать как способность рыб к различению качественно разных тестовых растворов, так и дифференциальную чувствительность рыб, сравнивая пары Т1^Т1 и Т1^Т2 как контрольную и тестовую реализации по вышеприведенной схеме обработки данных регистрации.

Модификацию претерпели также оценка знака реакции и оценка достоверности результатов. В исходной версии К_общ подразделялся на К_п и К_у, где К_п - общий показатель реагирования, равный отношению площади правой краевой зоны («хвоста», который отделяется от распределения пороговым сечением, см. п. 4 процедуры обработки данных регистрации) тестовой гистограммы к площади правой краевой зоны («хвоста») контрольной гистограммы (оценка изменения времени пребывания и числа рыб в тестовом отсеке бокса); К_у - то же, но для левых «хвостов» распределения (оценка изменения времени пребывания и числа рыб в альтернативном тестовому отсеке бокса) (Солуха, 1989, с. 71, из подписи к рис. 11). При этом ответная реакция рыб рассматривалась только как привлечение или избегание, и интенсивность ее проявления оценивалась по величине одного соответствующего показателя. В модифицированной версии методики при определении знака реакции и интенсивности ее проявления учитываются оба показателя: при К_у< 1 и К_п>1 — это «+», или привлечение к источнику стимула, при Ку>1 и К_п <1 - это «-», или избегание зоны поступления стимула, при К_у и К_п одновременно >1 - это «>», или увеличение, а при К_у и К_п одновременно <1 - это «<», или уменьшение двигательной активности, не ориентированное относительно источника стимула (Селиванова и др., 1989а, с.144-145). Интенсивность проявления реакции вычисляется по формуле ДК=Кп-К_у. Чем больше величина ДК (по модулю), тем сильнее проявляется реакция. В итоговой версии достоверность отличия реакции на стимул от реакции на эталон сравнения определяется по двум непараметрическим критериям: критерию X Колмогорова-Смирнова и Критерию знаков. Специфическими (когда стимулы распознаются) считаются реакции, достоверные по обоим критериям (p<0,05). Не­специфическими (когда стимулы ощущаются, но не распознаются, и знак реакции от опыта к опыту неустойчив) считаются реакции, уже не достоверные по критерию знаков, но еще достоверные по критерию Z.

С помощью модифицированной версии методики было установлено, что молодь русского осетра различает структурные (на примере а- и в—форм аланина) и оптические (на примере D- и L-форм и рацематов аланина и тирозина) изомеры аминокислот (Селивано­ва, Скотникова, 2007). Применяя итоговую версию методики, можно проверять способность рыб к различению не только двух соединений, но и отдельного соединения и смеси из двух и более соединений или двух разнокачественных смесей, предъявляемых в одинаковых молярных концентрациях. Примером такого применения методики служат данные по различению радужной форелью эквимолярных смесей аминокислот (Селиванова и др., 1989а).

При изучении дифференциальной чувствительности рыб мы проверяем их способность различать раствор данной концентрации С и растворы большей, т. е. С+ДС, или меньшей, т. е. С-ДС, концентраций одного и того же соединения. При исследовании чувствительности к увеличению концентрации соединения используются контрольная реализация С^С и тестовая реализация С^С+ДС, а при исследовании чувствительности к уменьшению концентрации соединения - контрольная реализация С+ДС^С+ДС и тестовая реализация С+ДС^С. Эта схема тестирования применяется для определения дифференциальной чувствительности как закономерности при меняющихся искусственных фонах С. При этом дифференциальный или разностный порог ДС определяется по результатам тестирования, а относительный дифференциальный порог (ОДП) вычисляется по формуле ДС/С. С помощью данной методики у наивной молоди русского осетра в широком диапазоне искусственных фонов были определены ОДП распознавания для пяти отдельных аминокислот и для многокомпонентных стимулов (натуральных экстрактов), включающих смеси аминокислот. ОДП распознавания для аминокислот и для многокомпонентных натуральных экстрактов составили соответственно 0,1% и 1%. Также в срединном диапазоне искусственных фонов для натуральных экстрактов и аминокислот выявлена закономерность, аналогичная формуле Вебера: lg (ДС/C^const (Селиванова, Скотникова, 2007). По этой же схеме тестирования, когда фоном служила природная волжская вода, были определены разностные пороги для отдельных аминокислот. Собственные данные по фоновым пулам АК в природной волжской воде, питающей заводские водоемы, в которых содержатся осетры, а также в самих водоемах (Селиванова, 1989; Селиванова и др., 1989б) позволили определить ОДП распознавания для отдельных аминокислот при естественном фоне: максимальный ОДП распознавания зарегистрирован для аланина - 33,11%, минимальный - для гистидина - 0,005%.

Для предъявляемых при естественном фоне аминокислот существует диапазон концентраций, в котором распознавание аминокислот уже исчезает, но ощущение (детекция) еще остается. По имеющимся зависимостям «S - R», где S - концентрация предъявляемой аминокислоты, а R - интенсивность регистрируемой реакции, были определены ОДП ощущения (детекции) аминокислот для молоди русского осетра при естественном фоне: максимальный - для глутаминовой кислоты - 2,75%, минимальный - для гистидина - 0,00006%.

Большую часть имеющихся материалов по хемочувствительности разных видов рыб еще предстоит опубликовать, но и по приведенным данным уже можно судить о возможностях модифицированной версии зоопсихофизической методики. Итоговая версия методики так же проста и наглядна, как метод парного выбора, но результат тестирования уже не зависит от мотивационного состояния животных. При этом, если метод парного или множественного выбора при одновременном сличении потоков разного качества или разной концентрации выявляет различительную чувствительность рыб на развилке потоков, то наша методика при последовательном сличении потоков разной концентрации выявляет дифференциальную чувствительность рыб при их движении по направлению к или от источника запаха по градиенту его концентрации. Необученные животные тестируются на фоне протока природной воды, и при исследовании дифференциальной чувствительности такой способ позволяет избежать влияния на результат тестирования как завышенной концентрации фона, так и зафиксированной в памяти животных концентрации стимула, при которой проходило предварительное обучение. Кроме того, в отличие от электрофизиологического метода, методика, совмещающая этологический и психофизический методы, позволяет напрямую оценивать чувствительность и различительную способность субъекта тестирования.

Диапазону применения методики с примерами полученных результатов посвящена отдельная статья (Селиванова, 2016). В частности, с помощью данной методики можно исследовать: различение и сигнальную роль отдельных веществ как при их непосредственном сличении, так и при сопоставлении знаков и показателей интенсивности проявления поведенческого ответа, зарегистрированных при независимом предъявлении; различение и сигнальную роль смесей и их компонентов; дифференциальную чувствительность к химическим стимулам как закономерность, т. е. в широком диапазоне искусственных фонов; дифференциальную чувствительность к натуральным веществам как точечное значение при естественном фоне; зависимости типа «доза-ответ» как аналог психометрической кривой человека; ключевую роль отдельных веществ в различных формах поведения рыб. Большинство подобных исследований проводятся с целью выявления закономерностей различительной хемочувствительности рыб, которые позволят успешно управлять их поведением при разного рода миграциях, промышленном лове и аквакультуре.

Данная версия методики может применяться для тестирования не только разных видов рыб и рыбообразных, но и для других гидробионтов, например, для головастиков амфибий.